Авторы: Гуреева Ольга, Vincent R. Racaniello

2.1. Прикрепление вируса к клеткам

Мы кратко рассмотрели структуру вирионов гриппа и процесс кодирования вирусными РНК одного и более белков. Теперь обратимся к размножению вирусов гриппа.

Вирусы – это исключительно внутриклеточные паразиты, они не могут воспроизводиться вне клетки. Появление новых инфекционных частиц должно протекать внутри клетки. Войдя в клетки, вирусы начинают паразитировать в структуре хозяина для воспроизводства вирусного потомства. Все события, происходящие в инфицированной вирусом клетке, называются инфекционным циклом, или вирусной репликацией. Вирусологи искусственно разделяют инфекционный цикл на несколько стадий, чтобы проще было его изучить. Эти стадии включают прикрепление и вхождение вириона, трансляцию мРНК в белок, репликацию генома (создание большего количества РНК или ДНК), скопление новых частиц и выход частиц из клетки. Мы рассмотрим каждую из названных стадий, а затем обсудим, как вирус гриппа инфицирует нас и вызывает болезнь.

Остановимся на первой стадии – прикреплении вириона к клетке. Возьмем обычную клетку, с которой, я уверен, знаком каждый. Но не будет лишним повториться.

Рисунок 8.

Вы можете видеть, что у клетки есть существенная преграда для проникновения в нее чего бы то ни было – цитоплазматическая мембрана. Вирусы задействуют различные механизмы для преодоления этого препятствия. Но объединяющим для них является то, что вирионы должны прежде всего прикрепиться к рецептору на цитоплазматической мембране для проникновения в клетку. Для каждого вируса имеется специфический рецептор, к которому он прикрепляется, и в свою очередь есть особенный вирусный белок, который прикрепляется к клеточному рецептору. На рис. 9 показан вирион гриппа, прикрепляющийся к его клеточному рецептору.

Рисунок 9.

Можно увидеть индивидуальные «шипы» на вирионе, подходящие к клеточной структуре. Вирусные шипы гриппа, прикрепляющиеся к клеточному рецептору, называются белком HA – гемагглютинином. Клеточный рецептор представляет собой сиаловую кислоту – небольшого объема сахар, прикрепленный ко множеству различных белков на поверхности клетки. На рис. 10 показано, как выглядит сиаловая кислота.

Рисунок 10.

Слева показан клеточный белок, прикрепленный к цитоплазматической мембране. Снизу изображена внутренняя часть клетки – цитоплазма. Часть белка пересекает мембрану, и также видны части цитоплазматической и внеклеточной сторон. Сферы – это сахара, прикрепленные ко множеству белков (белок + сахар = гликопротеин). Сиаловая кислота всегда является последним сахаром в цепи, которая прикрепляется к белку. Справа показана химическая структура сиаловой кислоты; следующий сахар (справа) – галактоза. Вирионы гриппа прикрепляются к клеткам, когда HA захватывает очень маленькую сиаловую кислоту.

Сахар в сравнении с HA в действительности очень мал – он подходит к небольшому кармашку на острие шипа. На рис. 11 изображена молекулярная модель, демонстрирующая, как HA прикрепляется к аналогу сиаловой кислоты. Шаровидный конец HA показан в верхней части рис. 11. Маленькие красные и белые сферы показывают места будущего прикрепления сиаловой кислоты – кармашки на верхнем конце HA.

Рисунок 11.

Мы показали, как вирион гриппа пристыковывается к поверхности клетки. Он сидит там достаточно прочно, но он все еще снаружи клетки. Дальше мы рассмотрим, как он проникает внутрь, точнее, как вирусные РНК проникают в клетку.

2.2. Прикрепление вируса гриппа к клеткам: роль различных сиаловых кислот

Мы уже видели, что прикрепление всех штаммов вируса гриппа A требует сиаловых кислот. Однако существует большое количество химически отличных друг от друга сиаловых кислот, и штаммы вируса гриппа в зависимости от этого меняются в своем подобии. Эти различия могут определять, какой вид животного будет инфицирован.

Из примера ниже видно, что сиаловая кислота прикреплена к галактозе сахара при помощи так называемой связи альфа(2,3). Это означает, что атом углерода в позиции номер 2 гексозы сиаловой кислоты присоединяется посредством атома кислорода к углероду в позиции 3 гексозы галактозы.

Рисунок 12.

Штаммы вируса птичьего гриппа присоединяются предпочтительно к сиаловым кислотам, прикрепленным к галактозе посредством связи альфа(2,3). Это главная сиаловая кислота на эпителиальных клетках пищеварительного тракта утки. Напротив, штаммы вируса гриппа человека предпочтительно прикрепляются к сиаловым кислотам, присоединенным к галактозе посредством связи альфа(2,6). Это основной тип сиаловой кислоты, представленной в эпителиальных клетках дыхательного тракта человека. Прикрепленные посредством альфа(2,3), сиаловые кислоты находятся на реснитчатых эпителиальных клетках, которых меньшинство в дыхательных путях человека, а также на некоторых эпителиальных клетках нижних дыхательных путей.

Эта рецепторная специфичность имеет различные последствия при заражении человека штаммами вируса птичьего гриппа. Например, высокопатогенные вирусы птичьего гриппа H5N1 размножаются лишь в ограниченном количестве в дыхательных путях человека благодаря присутствию некоторых клеток с сиаловыми кислотами, прикрепленными посредством связи альфа(2,3). Однако для эффективной передачи от человека к человеку необходимо, чтобы вирусы птичьего гриппа распознавали сиаловые кислоты, использующие связь альфа(2,6). В соответствии с этой гипотезой результаты исследований ранних изолятов вируса гриппа пандемий 1918, 1957 и 1968 гг. предполагают, что эти вирусы предпочтительно распознавали сиаловые кислоты, прикрепленные связью альфа(2,6).

Эпителиальные клетки трахеи свиньи производят сиаловые кислоты, присоединенные как связью альфа(2,3), так и связью альфа(2,6). Предполагают, что именно поэтому свиньи могут быть инфицированы штаммами и вируса птичьего гриппа, и гриппа человека и служить «миксером» для производства новых вирусов. Однако П. Пэлис (Peter Palese) высказывает сомнения по этому поводу в «The Great Influenza» Джона Бэрри:

«Доктор Питер Пэлис … рассматривает теорию «смесителя» как необязательную для объяснения антигенной изменчивости: “В равной степени может быть, что коинфекция вирусом птиц и человека у людей в одной клетке легкого может вызывать вирус… Нет причин тому, что смешивание не может произойти в легком, будь то свинья или человек. Неочевидно, что рецепторы сиаловой кислоты тех типов отсутствуют у других видов. Неочевидно, что те рецепторы птиц на самом деле отличаются от рецепторов человека, и с одной единственной заменой аминокислоты вирус может существовать еще лучше в другом хозяине”».

Рекомендуемая литература.

  • Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG, &Kawaoka Y (1998). Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. Journal of Virology, 72, 7367-7373.
  • Matrosovich M, Tuzikov A, Bovin N, Gambaryan A, Klimov A, Castrucci MR, Donatelli I, &Kawaoka Y. (2000). Early alterations of the receptor-binding properties of H1, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals. Journal of Virology, 74, 8502-8512.

2.3. Вхождение вирусных РНК гриппа в клетки

В последнем разговоре мы оставили нетронутый вирион на поверхности клетки. Следующая стадия – вхождение вирусной генетической информации (для вируса гриппа – это индивидуальные сегменты РНК) в клетку для получения возможности размножения. Механизм, проиллюстрированный на рис. 13, включает в себя стадию, на которой вирус становится мишенью для противовирусных адамантанов.

Рисунок 13.

Процесс вхождения вируса гриппа в клетки – наиболее понятный из всех известных механизмов проникновения вирусов. После прикрепления вириона к сиаловой кислоте, имеющей рецепторы на поверхности клетки, вирус-рецепторный комплекс входит в клетки посредством эндоцитоза – процесса, в ходе которого клетки обычно берут молекулы из внеклеточной жидкости. Пока эндосомальные везикулы, содержащие частицы вируса, движутся к ядру клетки, их pH понижается. Это изменение в pH завершает клеточный канал, закачивающий протоны (H+) в везикулу. Когда эндосомальная pH достигает 5,0, вирусный белок HA подвергается конформационной перестройке. Это изменение подвергает пептид слияния на HA короткой гидрофобной последовательности, вставляющей его в эндосомальную мембрану, которая от этого сливается с вирусной оболочкой. Когда это происходит, вирусные РНК проникают в цитоплазму. Затем они транспортируются в ядро клетки, где начинается размножение.

В вирионе гриппа вирусные РНК не оголены, поскольку к ним прикреплены вирусные белки, включая белок M1. Этот белок образует оболочку, лежащую в основе липидной мембраны вириона. К сожалению, если вирусные РНК прикрепляются к белку M1, когда выходят из вириона, они не могут достичь ядра. Для решения этой проблемы вирион гриппа имеет в своей мембране несколько копий белка, называемого M2. Этот вирусный белок образует канал в мембране, который активно закачивает протоны из эндосомы во внутреннюю часть вириона. Данные протоны понижают pH внутри вириона, освобождая вирусные РНК от M1. В этом случае РНК могут войти в ядро.

Ионный канал M2, являющийся мишенью для противовирусных адамантанов, показан на рис. 14. Эти образования забивают канал и не позволяют протонам закачиваться в вирион. В присутствии адамантанов вирусным РНК нужно прикрепляться к M1, отчего они не могут достичь ядра. Поэтому вирусная репликация подавляется. Устойчивость к адамантанам возможна при изменении в аминокислотах, прокладывающих канал M2. Такие изменения не дают лекарству забить канал.

Рисунок 14.

2.4. Расщепление HA – необходимое условие для инфективности

Гемагглютинин (HA) вируса гриппа – это вирусный белок, который прикрепляется к клеточным рецепторам (см. 2.1.). HA также играет важную роль во вхождении вирусной РНК в клетку, вызывая слияние вирусной и клеточной мембран. HA должен быть разделен клеточными протеазами, чтобы стать активным в качестве белка слияния.

HA на вирионе гриппа является триммером – он создан из трех копий полипептида HA. Сайт расщепления для протеаз клетки на белке HA расположен рядом с вирусной мембраной.

Рисунок 15.

На рис. 15 сферический конец белка HA, который прикрепляется к рецепторам клетки, изображен сверху, а вирусная мембрана – снизу. Для наглядности помечен только сайт расщепления HA. Нерасщепленная форма белка называется HA0; после расщепления клеточным ферментом образуются два белка, называемые HA1 (синий) и HA2 (красный). Две субъединицы остаются вместе на поверхности вирусной частицы. Новая амино(N)-концевая область HA2, образовавшегося при расщеплении, содержит последовательность гидрофобных аминокислот, называемых пептидом слияния. Во время вхождения вируса гриппа в клетки пептид слияния вставляется в эндосомальную мембрану и вызывает слияние вирусной и клеточной оболочек. Следовательно, вирусные РНК гриппа могут войти в цитоплазму. Процесс слияния описан в предыдущем параграфе.

Если белок HA не расщеплен, чтобы образовать HA1 и HA2, слияния не происходит. Поэтому вирусы гриппа с нерасщепленным HA не заразны. Расщепление вирусного HA происходит после того, как вновь синтезированные вирионы выходят из клетки. Вирусы гриппа эффективно размножаются в яйцах из-за присутствия протеазы в аллантоисной жидкости, способной расщеплять HA. Однако репликация многих штаммов вируса гриппа в культурах клеток требует добавления в среду соответствующей протеазы (как привило, трипсина).

У людей репликация вируса гриппа ограничена дыхательными путями, потому что это единственный участок, где производится протеаза, расщепляющая HA. Однако белок HA высокопатогенных штаммов H5 и H7 вируса птичьего гриппа может расщепляться протеазами, производимыми во многих различных тканях. В результате эти вирусы способны размножаться во многих органах птиц, включая селезенку, печень, легкие, почки и мозг. Это свойство объясняет способность штаммов H5N1 вируса птичьего гриппа размножаться вне дыхательных путей человека.

Подобно белкам HA высокопатогенных вирусов H5 и H7, HA штамма вируса гриппа 1918 г. может также расщепляться повсеместно присутствующими клеточными протеазами. Следовательно, вирус может размножаться в культурах клеток без добавления трипсина.

Белки HA H5 и H7 имеют множество основных аминокислотных остатков на сайте расщепления HA1-HA2, которые делают возможным расщепление посредством широко представленных протеаз. Но HA вируса гриппа H1 1918 г. не обладал этим свойством. Также N1 1918 г. не был в состоянии привлечь протеазы, которые расщепляли бы HA, т. е. не было механизма, позволяющего штамму A/WSN/33 вируса гриппа размножаться в клетках без трипсина. Понимание того, как белок HA вируса H1 1918 г. мог быть расщеплен протеазами – основной в понимании высокой патогенности данного штамма.

Рекомендуемая литература.

Chaipan, C., Kobasa, D., Bertram, S., Glowacka, I., Steffen, I., Solomon Tsegaye, T., Takeda, M., Bugge, T., Kim, S., Park, Y., Marzi, A., &Pohlmann, S. (2009). Proteolytic Activation of the 1918 Influenza Virus Hemagglutinin Journal of Virology, 83 (7), 3200-3211 DOI:10.1128/JVI.02205-08.

опубликовано 24/01/2014 14:55
обновлено 24/01/2014
ОРЗ, Инфекционные болезни, Инфекционные болезни

Комментарии

Для того чтобы оставить комментарий, пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь.

Скачивайте наши приложения