Авторы: Гуреева Ольга, Vincent R. Racaniello

3.1. Синтез РНК вируса гриппа

Когда РНК вируса гриппа с (-) нитью входит в ядро, они служат образцами синтезирования мРНК. Затем эти молекулы транспортируются обратно в цитоплазму, где они управляют синтезом вирусных белков. Однако мРНК не являются абсолютными копиями РНК с (-) нитью, так как у них отсутствуют последовательности и 5′-, и 3′-концов. Поэтому для производства большего количества РНК с (-) нитью, необходимых для сборки новых вирионов, образуется полноразмерная (+) нить, которая в свою очередь копируется в полноразмерную РНК с (-) нитью. После этого РНК с (-) нитью используются для образования новых вирионов. Этот процесс будет лучше понят по рис. 16, на котором разграничены процессы синтеза мРНК и репликации. РНК с (-) нитью – те, что присутствуют в вирионах. Эти процессы одинаковы для всех восьми сегментов вирусной РНК гриппа.

Рисунок 16.

Фермент, производящий РНК гриппа, известен как РНК-зависимая РНК-полимераза. Этот фермент, состоящий из вирусных белков PA, PB1 и PB2, присутствует в каждой вирусной частице. Если этот фермент отсутствует в вирионах, они никогда не запустят процесс инфицирования, поскольку вирусные РНК с (-) нитью не смогут транслироваться в белок, а в клетке нет ферментов, способных копировать такую длинную молекулу РНК. Безусловно, дополнительные молекулы вирусной РНК-полимеразы производятся в инфицированных клетках, однако фермент, привносимый в клетки вместе с вирионом, имеет решающее значение для запуска инфекционного цикла.

Вирусная РНК-полимераза гриппа – это праймер-зависимый фермент. Фермент не может копировать образец РНК с (-) нитью без маленькой частицы РНК, которая подстраивается под матричную РНК и обеспечивает начало процессу синтеза РНК. Праймеры для синтеза вирусных мРНК гриппа производятся из собственной коллекции клетки, состоящей из молекул мРНК. Вирусная РНК-полимераза гриппа в действительности расщепляет клеточные мРНК рядом с их 5′-концами, производя необходимые для синтеза РНК праймеры. Этот процесс можно назвать захватыванием кэпа, потому что праймеры производятся из 5′-концов мРНК клетки, которые имеют необычную химическую структуру, именуемую «кэп» (помечено буквой «с» на рис. 16). Захватывание кэпа является также особенностью синтеза мРНК других вирусов.

Поскольку РНК-зависимых РНК-полимераз нет в клетках млекопитающих, они являются отличной мишенью для подавления противовирусными соединениями. По меньшей мере одно новое противовирусное лекарство, нацеленное на этот фермент, T-705, находится сейчас в разработке.

3.2. Подверженные ошибкам пути синтеза РНК

Изучив синтез вирусной РНК гриппа, мы должны вернуться несколько назад и рассмотреть очень важное свойство, касающееся репликации вируса. Все полимеразы нуклеиновой кислоты вносят разнообразие, позволяющее эволюционировать вирусу в беспрецедентных масштабах. Иными словами, вирусы столь успешны, потому что допускают множество ошибок.

Нуклеиновые кислоты – удивительные молекулы не только потому, что они могут кодировать белки, но и потому, что могут копироваться или размножаться. Копирование производится полимеразами нуклеиновой кислоты, которая «считывает» штамм ДНК или РНК и синтезирует комплементарный штамм. Начнем с изучения синтеза ДНК. На рис. 17 показана цепь ДНК, состоящая из оснований A, G, C или T, связанных вместе и несущих информацию о специфическом белке. В этом примере матричная цепь показана внизу; она состоит из оснований A, C, C, T, G, A, C, G и G (слева направо). ДНК-полимераза копирует эту матричную цепь для образования комплементарной цепи. Мы подошли к тому, что для роста цепи ДНК были добавлены комплементарные основания T, G, G, A и C. Следующим шагом будет добавление T, являющегося комплементарным основанием для A на матричной цепи (рис. 17).

Рисунок 17.

До этого момента все шло хорошо. Но все полимеразы нуклеиновой кислоты несовершенны и время от времени делают ошибки. Это означает, что они вставляют неверную кислоту. На рис. 18 показано, как ДНК-полимераза вставляет A вместо необходимого G.

Рисунок 18.

Вставка неверного основания приводит к мутации – изменению в последовательности ДНК. В целом, создание новых ДНК со множеством мутаций – не лучшая идея, поскольку кодированный белок не будет хорошо функционировать (хотя есть и исключения, как мы увидим). Но в данном случае решение будет следующим: ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (ферменты, копирующие матричную ДНК в ДНК) обладают способностью к исправлению ошибок. Ошибки исправляет фермент экзонуклеаза, который распознает несоответствующие пары оснований A-C и удаляет непригодный A. После этого ДНК-полимераза делает еще одну попытку, и в этот раз вставляется верная G (рис. 19).

Рисунок 19.

Несмотря на то что ДНК-полимеразы имеют способность к исправлению ошибок, они все равно совершают их – примерно одна ошибка включения на 107 – 109 полимеризованных нуклеотидов. Однако РНК-полимеразы РНК-вирусов – главные в допущении ошибок. Эти ферменты совершают одну ошибку на каждые 1000 – 100000 полимеризованных нуклеотидов. Эти ферменты делают ошибки, но не могут исправить их. Поэтому мутации остаются во вновь синтезированной РНК.

С учетом того, что геном типичной вирусной РНК насчитывает 10000 оснований, частота 1 в 10000 соответствует в среднем одной мутации на каждый воспроизведенный геном. Если единичная клетка, инфицированная полиовирусом, производит 10000 новых вирусных частиц, то в теории по этому коэффициенту ошибок будет произведено 10000 новых вирусных мутантов. Такой огромный уровень мутации объясняет, почему РНК-вирусы развиваются так быстро. Примером служит то, что это движущая сила позади вирусного антигенного дрейфа гриппа.

Это великолепный образец последовательностей коэффициента ошибок полимеразы РНК. Десятки миллионов человек инфицированы ВИЧ-1, и каждый инфицированный человек производит миллиарды вирусных геномов ежедневно, каждый с одной мутацией. Более 1016 геномов производятся каждый день по всей планете. Как следствие, ежедневно случайно возникают тысячи мутантов, устойчивых ко всем комбинациям противовирусных составов, которые используются или только разрабатываются.

Я не могу переоценить важность подверженного ошибкам синтеза нуклеиновых кислот в процессе эволюции вирусной РНК и производстве болезни. Дальнейший материал будет посвящен изучению последовательностей репликации, подверженной ошибкам. Вначале мы обсудим последствия для вирусов как популяции, а затем рассмотрим, что получается в результате производства вирусом полимераз РНК, которые допускают меньшее количество ошибок. Будьте терпеливы, поскольку мы слегка отклонимся от вируса гриппа; излагаемые концепции станут важным и хорошим инструментом в вашем наборе знаний по вирусологии.

3.3. Концепция квазивидов

Рисунок 20.

До конца 1970-х гг. разнообразие вирусных популяций не было широко оценено по достоинству. Первое исследование, посвященное количественному описанию вирусного разнообразия, было проведено с привлечением бактериофага Q-бэта РНК. Авторы сделали удивительные выводы, основанные на анализе варьирования в линиях вирусов:

«Популяция фага Q-бэта находится в динамическом равновесии, с вирусными мутантами, появляющимися в высоком проценте, с одной стороны, и подвергаемыми строгому отбору – с другой. Геном Q-бэта не может быть описан как определенная уникальная структура, а скорее, как средневзвешенная величина большого количества различных индивидуальных последовательностей.»

Это варьирование, являющееся следствием подверженной ошибкам природы вирусной репликации, подтверждается с тех пор и при использовании других вирусных систем. Теперь ученые понимают, что вирусные популяции не состоят из единообразных составляющих с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты. Скорее, они являются динамичными распределениями неидентичных, но родственных членов, называемых квазивидами. Они получили такое название, поскольку классическое определение видов – популяция особей с интербридингом – не имеет смысла в отношении вирусов.

Важность квазивидов в том, что большинство вирусных инфекций запускается не единичным вирионом, а популяцией частиц. Потомство, возникающее после инфицирования, появляется благодаря избирательным силам, действующим внутри инфицированного хозяина. Вирионы, выходящие для инфицирования нового хозяина, прошли через другой набор внешних избирательных сил. Устоявшаяся популяция вирусных квазивидов состоит из огромного числа частиц.

На рис. 20 показано небольшое подмножество вирусных геномов, присутствующих в линии вируса. Геномы показаны линиями, а мутации – различными символами. Консенсусная последовательность для этой популяции показана линией снизу. В консенсусной последовательности нет мутаций, хотя каждый вирусный геном их содержит. Это происходит потому, что мутации не представлены на достаточно высоких уровнях, чтобы достичь консенсуса в какой бы то ни было позиции.

Хотя эта концепция может показаться неясной, впоследствии мы рассмотрим многие аспекты вирусной биологии, которые сделают ее очевидной. Ключевым моментом становится то, что последовательности генома вирусов собираются вокруг средней последовательности, но каждый геном, возможно, отличается от этого консенсуса. Это означает, что последовательности новых вирусов гриппа H1N1, указанные в NCBI илиGISAID, представляют консенсус и не представляют популяцию, которая заразила кого-либо из тысяч человек в Мексике в течение последнего месяца. Луис Вилларил (Luis Villareal), знаменитый исследователь эволюционной вирусологии, высказал такие соображения по поводу квазивидов и текущей эпидемии гриппа:

«Исследователи гриппа верят в эталонный копир как в наиболее приспособленный тип. Я думаю, это идет им во вред и в настоящее время сбивает с толку, когда мы становимся свидетелями эволюции. Я готов побиться об заклад, что если состав квазивидов будет измерен, то мы увидим ясные различия между теми пациентами, что скончались в Мексике, и пациентами в США, которые столкнулись с гораздо менее вирулентными последствиями.»

До недавнего времени было невозможно определить последовательности всех вирусных геномов, присутствующих в популяции, как показано на рис. 20. Развитие методов глубокого секвенирования (например, 454 пиросеквенирования) сделало это возможным для изучения квазивидов. Используя данный метод, можно определить индивидуальные варианты внутри вирусной популяции.

Далее мы рассмотрим, каким образом давление отбора внутри хозяина может изменять квазивиды.

Рекомендуемая литература.

3.4. Вирусные квазивиды и феномен «бутылочного горлышка»

Последовательность геномов популяции РНК-вирусов собирается вокруг консенсуса средней последовательности, но каждый геном отличен от других. Редкий геном с особенной мутацией способен выжить в процессе отбора, и поэтому мутация будет присутствовать во всем потомстве геномов. Процесс отбора представлен на рис. 21.

Рисунок 21.

На рисунке слева изображены небольшие подмножества вирусных геномов, присутствующих в линии вирусов. Геномы показаны линиями, а мутации – различными символами. Консенсусная последовательность этой популяции показана на нижней линии. В консенсусной последовательности нет мутаций, хотя они есть у каждого вирусного генома. Один из этих геномов, помеченный стрелкой, способен выжить в процессе отбора (который еще называют генетическим «бутылочным горлышком»), например, при переходе в нового хозяина. Этот вирус размножается в хозяине, и возникает новая популяция вирусов, показанная в правой части рис. 21. Консенсусная последовательность для этой популяции показывает, что у каждого члена популяции присутствует три мутации, для того чтобы он мог выжить в процессе отбора «бутылочное горлышко». Подверженная ошибкам репликация гарантирует, что члены новой популяции имеют много других мутаций в своих геномах.

Тип отбора популяции, показанный на рис. 21, с наибольшей вероятностью будет иметь место во время появления нового вируса гриппа H1N1, который в настоящее время циркулирует по всему миру. Представьте, что левая верхняя часть рис. 21 представляет последовательности одного вирусного сегмента РНК вируса гриппа, который заражает свинью. Животное чихает, и несколько миллионов вирусных частиц вдыхается оказавшимся рядом человеком. Изо всех вдыхаемых рабочим вирионов только один, рядом со стрелкой, может эффективно размножаться в клетках человека. Затем изо всех вирусов, размножающихся в дыхательных путях человека, в этом сегменте РНК происходят только три мутации. Представьте подобный процесс отбора, приводящий к новой популяции вирусов, который был бы столь же хорошо приспособлен для передачи от человека к человеку.

Теория квазивидов позволяет предположить, что вирусы – это не просто собрание случайных мутантов, а взаимодействующая группа вариантов. Разнообразие популяции – необходимость для распространения вирусной инфекции. Недавно стало возможным провести эксперименты для проверки идеи, по которой именно вирусные популяции, а не отдельные мутанты, являются мишенью для отбора. Вскоре мы поговорим об этой теории.

опубликовано 24/01/2014 14:55
обновлено 24/01/2014
ОРЗ, Инфекционные болезни, Инфекционные болезни

Комментарии

Для того чтобы оставить комментарий, пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь.

Скачивайте наши приложения