Авторы: Гуреева Ольга, Vincent R. Racaniello

7.1. Выращивание вируса гриппа в яйцах

Рисунок 40.

Перед развитием в культуре клеток многие вирусы культивируются в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. На сегодняшний день этот метод в большинстве случаев используется для выращивания вируса гриппа. Превосходный урожай вируса из куриных яиц привел к их широко распространенному использованию в исследовательских лабораториях и при производстве вакцин. В действительности подавляющее большинство противогриппозных вакцин, как инактивированных, так и инфекционных, производится в куриных яйцах. Как вирус гриппа размножается в яйцах?

Рис. 41 демонстрирует срез куриного яйца с развивающимся эмбрионом. Показаны различные пути инокуляции в яйцо, так же как и различные отделения, где размножаются вирусы.

Рисунок 41.

Для размножения вируса гриппа используются свободные от патогена яйца 11 – 12-го дня после оплодотворения. Яйцо располагают перед источником света для определения области аллантоисной полости без прожилок, расположенной под воздушным мешком. Она помечается карандашом. После того, как все яйца просвечены таким образом, делается небольшая зарубка в скорлупе в этой позиции с использованием ювелирного резца. Затем просверливается отверстие сверху яйца при помощи моторизированного инструмента Дремеля (Dremel). Если этого не сделать, то после введения вируса давление в воздушном мешке просто вытеснит посевной материал.

После того как на всех яйцах поставлена зарубка и они просверлены, в них вводится вирус при помощи шприца для инъекций туберкулина – шприц на 1 мл, заполненный на ½ дюйма, стрелка указателя в позиции 27. Игла проходит через отверстие в скорлупе, сквозь хориоаллантоисную мембрану, и вирус помещается в аллантоисной полости, заполненной аллантоисной жидкостью. Два отверстия в скорлупе запечатываются расплавленным парафином, и яйца помещают на 48 часов в термостат, установленный на 37°С.

В течение инкубационного периода вирус размножается в клетках, составляющих хориоаллантоисную мембрану. Так как новые вирусные частицы образуются почкованием (см. 4.1.), они выходят в аллантоисную жидкость. Чтобы собрать вирус, удаляют верхушку яичной скорлупы – часть, покрывающую воздушный мешок. Для этого когда-то мы пользовались специальным инструментом, который располагался над яйцом. Было легко удалить эту часть скорлупы пинцетом. Скорлуповая оболочка и хориоаллантоисная мембрана протыкались пипеткой, которая использовалась для удаления аллантоисной жидкости – примерно 10 мл в каждой яйце. Достаточное количество вируса для производства 15 мкг дозы вакцины могло быть собрано из одного или двух яиц (в зависимости от штамма вируса).

Когда-то мы выращивали так много вируса гриппа, что большая термальная комната с отдельным входом использовалась как инкубатор для яиц. Когда вы открывали дверь инкубатора и слышали писк, это значило, что кто-то оставил неиспользованные яйца на слишком долгое время и они вывелись. В этом случае вам предстояло поймать неуловимых цыплят.

Взрослые обладают перекрестно-реагирующими антителами к A/California/04/2009 (H1N1)

[Главы нет в содержании, но есть ссылка на нее из глав 7.2. и 7.3.]

Дает ли предыдущее знакомство с вирусами гриппа H1N1, обусловленное заражением или вакцинацией, какую-либо защиту против заражения новыми штаммами H1N1? Ответ на этот вопрос может прояснить, почему свыше 60% подтвержденных случаев гриппа были вызваны вирусами, подобными вирусам свиного гриппа H1N1, в США у людей от 5 до 24 лет, как сообщалось на пресс-конференции CDC.

Для ответа на этот вопрос CDC проанализировал образцы сыворотки, собранные в течение предыдущих исследований вакцины. Эти сыворотки собрали от детей и взрослых до и поле того, как их привили вакциной против гриппа, в сезоны гриппа 2005 – 2006, 2006 – 2007, 2007 – 2008 и 2008 – 2009 гг. Применялись методы нейтрализации вируса и торможения гемагглютинации для определения того, содержат ли эти сыворотки антитела, перекрестно-реагирующие с новым штаммом H1N1. В качестве образца новых изолятов вируса H1N1 использовался A/California/04/2009.

Результаты показали, что предварительная вакцинация детей (в возрасте от 6 месяцев до 9 лет, всего 79 образцов) или сезонной тривалентной инактивированной вакциной, или инфекционной аттенуированной противогриппозной вакциной в предыдущие 4 года не вызвала перекрестно-реагирующих антител для ответа на A/California/04/2009 у взрослых. Среди людей возраста от 18 до 64 лет был двукратный рост перекрестной реактивности антител к вирусу в сравнении с 12 – 19-кратным ростом в титрах антител против сезонных штаммов. У людей старше 60 лет не было роста кросс-реактивности антител. Эти данные показывают, что иммунизация сезонной противогриппозной вакциной, содержащей прежние штаммы H1N1 (2005 – 2009 гг.), похоже, не дает защиты против инфицирования новыми штаммами H1N1.

Важным является вопрос, содержат ли сыворотки, полученные до введения вакцины, перекрестно-реагирующие титры антител против A/California/04/2009. Такой анализ показал бы, дает ли естественное заражение штаммами H1N1 некоторую защиту против новых изолятов. У 79 детей в возрасте от 6 месяцев до 9 лет до вакцинирования не было обнаружено перекрестно-реагирующих антител в сыворотке к A/California/04/2009. Однако 6% взрослых в возрасте от 18 до 40 лет, 9% – от 18 до 64 лет и 33% старше 60 лет имели перед вакцинацией нейтрализующие титры антител к A/California/04/2009 выше 160 или равные этому значению. Эти антитела, скорее всего, были приобретены с инфицированием вирусом H1N1, по антигенным свойствам более близким к A/California/04/2009, чем к другим штаммам сезонного H1N1. Неизвестно, могут ли эти антитела дать защиту против заражения, но они могут уменьшить тяжесть симптомов болезни.

Я подозреваю, что не все знакомы с методами микронейтрализации и торможения гемагглютинации, используемыми в этом исследовании. Впоследствии я объясню механизм действия этих методов и важность их результатов.

Рекомендуемая литература.

  • J Katz, PhD, K Hancock, PhD, V Veguilla, MPH, W Zhong, PhD, XH Lu, MD, H Sun, MD, E Butler, MPH, L Dong, MD, PhD, F Liu, MD, PhD, ZN Li, MD, PhD, J DeVos, MPH, P Gargiullo, PhD, N Cox, PhD (2009). Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine Morbid. Mortal. Weekly Rep., 58 (19), 521-524.

7.2. Метод торможения гемагглютинации гриппа

Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что некоторые взрослые имеют сывороточные перекрестно-реагирующие антитела к новому вирусу гриппа H1N1. Чтобы сделать такой вывод, использовали одну из методик, называемую методом торможения гемагглютинации. Как он действует?

Чтобы понять метод торможения гемагглютинации, мы должны рассмотреть анализ гемагглютинации. Частицы вируса гриппа имеют оболочечный белок, называемый гемагглютинином, или HA (см. 1.1.), который прикрепляется к рецепторам сиаловой кислоты на клетках (см. 2.1.). Вирус также будет прикрепляться к эритроцитам (красным кровяным тельцам), вызывая образование решетки. Это свойство называется гемагглютинацией и является основой для быстрого анализа с целью определения уровней присутствующего вируса гриппа в образце. Для проведения анализа готовятся двукратные последовательные разведения вируса, смешиваются с определенным количеством красных кровяных телец, и добавляются в лунки пластмассового планшета. Красные кровяные тельца, которые не связались вирусом гриппа, оседают на дно лунки и образуют «пуговицу». Красные кровяные тельца, прикрепившиеся к вирусным частицам, образуют решетку, покрывающую лунку. Анализ может быть проведен в течение 30 минут, и поэтому является быстрым показателем относительных количеств вирусных частиц.

Рисунок 42.

На рис. 42 показаны подготовленные двукратные разведения образцов различных вирусов гриппа (A – H), смешанные с красными кровяными тельцами курицы и добавленные в лунки 96-луночного планшета. Спустя 30 минут лунки сфотографировали. Образец A вызвал гемагглютинацию до пропорции 1:256 разведения, поэтому титр HA линии вирусов составил 256. Образец в ряду B содержит неопределившийся вирус, тогда как вирус в ряду D имеет титр HA 512.

Анализ HA можно легко видоизменить для определения уровня антител к вирусу гриппа, присутствующего в образцах сыворотки. В исследовании CDC, которое мы скоро процитируем, авторы хотели определить, содержат ли заготовленные образцы сыворотки антитела к новому штамму гриппа H1N1. Вначале они получили препарат одного из новых вирусов гриппа, а именно A/California/04/2009, и определили его титр HA с помощью описанного только что метода. Они добавили определенное количество вируса в каждую лунку 96-луночного планшета, равного 32 – 63 единицам HA. Затем были приготовлены двукратные разведения каждой сыворотки для тестирования, и каждая серия разведения была добавлена по рядам лунок. Наконец, добавили красные кровяные тельца и инкубировали в течение получаса.

Основа метода торможения гемагглютинации в том, что антитела к вирусу гриппа будут препятствовать прикреплению вируса к красным кровяным тельцам. Поэтому гемагглютинация подавляется в присутствии антител. Наивысшее разведение сыворотки, останавливающее гемагглютинацию, называется титром торможения гемагглютинации сыворотки. Если сыворотка содержит антитела, вступающие в реакцию с новым штаммом H1N1, то гемагглютинация будет наблюдаться во всех лунках. Подобным образом, если присутствуют антитела к вирусу, гемагглютинация не будет наблюдаться до тех пор, пока антитела не разведутся в достаточной мере.

В отчете CDC утверждается: «титры антител сывороточного торможения гемагглютинации при значении 40 означают снижение риска инфицирования гриппом или болезни в популяции как минимум на 50%». Титр антител при значении 40 означает, что при разведении 1:40, но не выше, сыворотка блокирует гемагглютинацию. Определяя титры торможения гемагглютинации и сравнивая их с уровнями поражения гриппом в популяциях, возможно подсчитать значимость титра антител торможения гемагглютинации в отношении чувствительности к инфекции вируса гриппа. Используемый в этих целях, метод торможения гемагглютинации является мощным эпидемиологическим инструментом.

Рекомендуемая литература.

  • J Katz, PhD, K Hancock, PhD, V Veguilla, MPH, W Zhong, PhD, XH Lu, MD, H Sun, MD, E Butler, MPH, L Dong, MD, PhD, F Liu, MD, PhD, ZN Li, MD, PhD, J DeVos, MPH, P Gargiullo, PhD, N Cox, PhD (2009). Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine Morbid. Mortal. Weekly Rep., 58 (19), 521-524.
  • Potter, CW, & Oxford, JS (1979). Determinants of immunity to influenza infection in man. Br Med Bull, 35, 69-75.

7.3. Анализ микронейтрализации гриппа

Анализ микронейтрализации – другой метод, с помощью которого Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что некоторые взрослые имеют перекрестно-реагирующие антитела к новому вирусу гриппа H1N1. Рассмотрим, как действует этот метод.

Репликация вируса часто исследуется в лаборатории путем инфицирования клеток, выращиваемых в пластмассовых планшетах или колбах, которые обычно называются клеточными культурами. На рис. 43 – пример клеток HeLa, убиваемых полиовирусом.

Рисунок 43.

Верхний левый квадрат показывает неинфицированные клетки, а другие части показывают клетки в течение определенного времени после заражения. По мере размножения вируса зараженные клетки округляются и отделяются от планшета с культурой клеток. Эти видимые изменения называются цитопатическим эффектом.

Есть и другой путь сделать видимым уничтожение клеток вирусом без использования микроскопа – окрашивание клеток красителем. На рис. 44 клетки были расположены в маленьких лунках 96-луночного планшета. В одну лунку добавили вирус, а в другие – нет. После периода инкубации клетки окрасились в кристаллический фиолетовый, который окрашивает только живые клетки. Видно, какие клетки были поражены вирусом, а какие нет.

Рисунок 44.

Мы можем использовать этот визуальный метод для определения того, обладает ли образец сыворотки антителами для блокировки вирусного заражения. Если сыворотка содержит антитела для блокирования вирусной инфекции, тогда клетки выживут, как было определено при окрашивании кристаллическим фиолетовым. Если противовирусные антитела отсутствуют в сыворотке, то клетки погибнут.

В описанном виде данный анализ говорит нам только о том, имеются противовирусные антитела в образце сыворотки или нет. Чтобы сделать данный анализ количественным, готовятся двукратные разведения сыворотки, и каждая смешивается с вирусом, после чего используется для заражения клеток. При низких разведениях антитела будут блокировать инфекцию, а при максимальных разведениях количества антител окажется слишком мало, чтобы проявился эффект. Обычный процесс разведения дает возможность сравнить нейтрализующие вирус способности различных сывороток. Титр нейтрализации выражается как эквивалент наибольшего разведения, при котором блокируется вирусная инфекция.

Рисунок 45.

На рис. 45 показано, как сыворотка блокирует вирусную инфекцию при разведениях 1:2 и 1:4, но блокирование проявляется в меньшей степени при разведении 1:8 и отсутствует в пропорции 1:16. Каждое разведение сыворотки тестировалось трижды для большей точности. В данном случае титр нейтрализации составит 4 – эквивалент последнего разведения, при котором инфекция полностью блокировалась.

Это объяснение должно прояснить, как получают титры нейтрализации, которые звучат в отчете CDC, цитируемом ниже. Кстати, микронейтрализация попросту означает, что анализ нейтрализации был проделан в небольшом формате, таком как 96-луночный планшет, вместо того чтобы использовать большие планшеты с культурами клеток.

Авторы исследования, проведенного в CDC, отмечают, что «хотя титры антител сывороточного торможения гемагглютинации при значении 40 указывают на снижение риска заражения гриппом или заболевания в популяциях как минимум на 50%, нет такой корреляции в отношении защиты для титров антител микронейтрализации». Они использовали математический анализ для определения отношений между торможением гемагглютинации и титрами микронейтрализации. Было обнаружено, что сыворотки от детей с титром HI 40 соответствовали титрам микронейтрализации 40. Однако у взрослых титр HI 40 соответствовал титру микронейтрализации 160 и выше. Я не могу назвать причину такого различия, но возможно, что не все нейтрализующие антитела в сыворотке взрослых способны подавлять гемагглютинацию. Чтобы понять, почему такое возможно, нужно рассмотреть, как антитела блокируют вирусную инфекцию.

Рекомендуемая литература.

  • J Katz, PhD, K Hancock, PhD, V Veguilla, MPH, W Zhong, PhD, XH Lu, MD, H Sun, MD, E Butler, MPH, L Dong, MD, PhD, F Liu, MD, PhD, ZN Li, MD, PhD, J DeVos, MPH, P Gargiullo, PhD, N Cox, PhD (2009). Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine Morbid. Mortal. Weekly Rep., 58 (19), 521-524.

7.4. Определение вирусов: анализ бляшкообразования

Одним из наиболее важных процессов в вирусологии при измерении титра вируса является концентрация вирусов в образце. Широко используемый подход для определения количества инфекционного вируса – это анализ бляшкообразования. Данная методика впервые была разработана для подсчета титров линии бактериофагов. Р. Дульбекко (Renato Dulbecco) модифицировал этот процесс в 1952 г. для использования в вирусологии животных, и с тех пор он используется для надежного определения титров многих различных вирусов.

Рисунок 46.

Для проведения анализа бляшкообразования приготавливают 10-кратные разведения линии вирусов и вводят 0,1 мл аликвоты в чувствительные клеточные монослои. После инкубационного периода, во время которого вирус прикрепляется к клеткам, монослои покрываются питательной средой, содержащей вещество (обычно агар), способствующее образованию геля. Когда планшеты инкубируют, в изначально зараженных клетках выводится вирусное потомство. Распространение новых вирусов ограничено гелем до соседних клеток. Следовательно, каждая инфекционная частица производит круговую зону зараженных клеток, называемую бляшкой. В итоге бляшка становится достаточно большой, чтобы стать видимой невооруженным глазом. Краситель, помечающий живые клетки, часто используется для усиления контраста между живыми клетками и бляшками. Этим способом пригоден для анализа только тех вирусов, которые причиняют видимый ущерб клеткам. Пример бляшек, образованных полиовирусом на монослое клеток HeLa, показан на рис. 46. Клетки окрашены кристаллическим фиолетовым, а бляшки без труда видны там, где клетки разрушены вирусной инфекцией.

Титр линии вируса может быть подсчитан в бляшкообразующих единицах (PFU) на миллиметр. Для определения титра вируса подсчитываются бляшки. В целях снижения погрешности подсчитываются только планшеты, содержащие от 10 до 100 бляшек, в зависимости от размера используемого планшета с культурой клеток. Согласно правилам статистики, при подсчете 100 бляшек титр образца будет варьироваться в пределах ± 10%. Каждое разведение проводится дважды для повышения точности. На рис. 47 показано 17 бляшек на планшете, сделанном из разведения 10-6. Поэтому титр вируса составит 1,7 × 108 PFU/мл.

Рисунок 47.

Впоследствии мы обсудим, как анализ бляшкообразования может использоваться для приготовления клональных линий вирусов – очень важной стадии в исследовании вирусной генетики.

Рекомендуемая литература.

  • Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279.

7.5. Сколько вирусов требуется для образования бляшки?

Анализ бляшкообразования – главный инструмент для определения титров вируса. Идея проста: вирусная инфекция ограничивается до соседних клеток полутвердым верхним слоем. Подсчитывая количество бляшек, можно вычислить титр вируса в PFU на мл. Основной вопрос: сколько нужно вирусов для формирования одной бляшки?

Для большинства вирусов животных одной инфекционной частицы бывает достаточно для начала инфекции. К этому выводу можно прийти, изучая отношения между количеством вирусных частиц и подсчетом бляшек. Линейная зависимость означает, что бляшку может образовать одна инфекционная частица. Считается, что в этом случае вирус заразил клетку с динамикой в один удар. Эта концепция продемонстрирована на рис. 48. Количество бляшек, образованных с динамикой одного или двух ударов показано на графике в сравнении с относительной концентрацией вируса.

Рисунок 48.

Есть некоторые примеры вирусов с динамикой в два удара, другими словами, два различные типа вирусных частиц должны заразить клетку для запуска инфекционного цикла. Примеры включают геномы некоторых РНК вирусов растений с (+) нитью, состоящие из двух молекул РНК, упакованных в различные частицы. Кривая зависимости от дозы подобных вирусов, скорее, параболическая, чем линейная.

Когда единичная вирусная частица способна образовать бляшку, вирусное потомство внутри бляшки представляет собой клоны. Вирусная линия, приготовленная из единичной бляшки, называется очищенной линией вирусов из бляшки. Чтобы приготовить такую линию вирусов, наконечник маленькой пипетки вставляют в верхний слой агара над бляшкой. Пробка агара удаляется и помещается в буферный раствор. Вирусы в пробке агара перемещаются в буферный раствор, который затем можно использовать для заражения клеточных культур. Для обеспечения чистоты этот процесс обычно повторяют как минимум еще раз. В значительной степени очищение бляшки используется в вирусологии для основания клональных линий вирусов. Способность подготовки клональных линий вирусов было важным шагом, позволившим проводить генетический анализ вирусов.

7.6. Измерение вирусов методом конечного разведения

Анализ бляшкообразования – замечательный метод определения титров вируса, но он не применим для всех вирусов. К счастью, доступно несколько альтернативных методов, включая метод конечного разведения.

Метод конечного разведения использовался для измерения титра вируса до развития метода бляшкообразования и все еще применяется для вирусов, не образующих бляшек. Подготавливаются последовательные разведения линии вируса, которые вносятся в копируемые культуры клеток, часто в многолуночных форматах (например, в 96-луночный пластмассовый планшет). Количество заражаемых культур клеток определяется впоследствии для каждого разведения вируса, обычно путем поиска цитопатического эффекта.

В данном примере метода конечного разведения каждый из 10 монослоев клеточных культур был инфицирован разведением вируса. После инкубационного периода планшеты, показавшие цитопатические эффекты, были помечены +. При высоких разведениях ни одна из клеточных культур не была заражена, так как не было частиц. При низких разведениях каждая культура клеток была инфицирована. Половина клеточных культур показала цитопатические эффекты при разведении 10-5. Это и есть конечная точка: разведение вируса, при котором 50% клеточных культур оказалось заражено. Это количество может быть высчитано на основании данных и выражено как 50% инфекционной дозы (ИД50) на миллилитр. Линия вирусов в приведенном примере содержит 105 ИД50 на мл.

Рисунок 49.

В реальной жизни конечная точка со значением 50% обычно не встречается, как мы показали на примере разведения. Поэтому привлекаются статистические методы подсчета конечной точки титрования.

Методы конечного разведения также могут использоваться при определении вирулентности вируса у животных. Применяется тот же подход: производятся последовательные разведения вирусов и вводятся в ряд подопытных животных. Заражение животного можно определить по его смерти или клиническим симптомам, таким как повышенная температура, потеря веса или паралич. Результаты выражаются в виде 50% летальной дозы (LD50) на мл или 50% паралитической дозы (PD50) на мл, когда смертность или паралич используются как конечные точки.

Следующий пример поясняет использование конечного разведения при подсчете смертности от полиовируса у мышей. Восьми мышам ввели разведение вируса, а конечной точкой была смерть. Статистический метод Рида – Мюнха использовался для определения конечной точки со значением 50%. В этом методе объединены результаты, и смертность подсчитана для каждого разведения. Конечная точка в 50%, которая находится между пятым и шестым разведениями, подсчитана как 10-6,5. Поэтому образец вируса содержит 106,5 LD50 единиц.

Рисунок 50.

Рекомендуемая литература.

  • Reed, L.J., & Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hygiene, 27, 493-497.

Перевод Гуреевой Ольги

Гуреева Ольга в КлубКоме

опубликовано 24/01/2014 14:55
обновлено 24/01/2014
ОРЗ, Инфекционные болезни, Инфекционные болезни

Комментарии

Для того чтобы оставить комментарий, пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь.

Скачивайте наши приложения